三种常用的细胞增殖、毒性检测方法的原理、特点与比较
同时检测LDH释放及活细胞（MTT、CCK-8等方法）的文献数量变化
（本数据由同仁化学研究所调查）
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方法
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MTT法
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CCK-8法
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LDH法
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产品
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MTT
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CCK-8（CK04）
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Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®(CK12)
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检测对象
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活细胞
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活细胞
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死细胞
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检测结果
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细胞存活率
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细胞存活率
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细胞死亡(损伤)率
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用途
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细胞增殖毒性
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细胞增殖毒性
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细胞毒性、细胞损伤
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底物
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MTT
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WST®-8
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WST®
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底物作用对象
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线粒体内脱氢酶
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细胞内脱氢酶
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乳酸脱氢酶（LDH）
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检测方法
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比色法
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比色法
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比色法
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Formazan水溶性
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不溶于水
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溶于水
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溶于水
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优点
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成本低
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重现性好
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无需使用放射性同位素51Cr
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灵敏度高
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适合做效靶细胞实验
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操作简便
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适合做ADCC、CART实验
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试剂稳定性高
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试剂稳定性高
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对细胞毒性小
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对细胞毒性小
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Formazan溶于水
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适合高通量筛选
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缺点
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Formazan不溶于水，需用有机溶剂溶解
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CCK-8试剂和酚红颜色接近，有时会有漏加或多加的情况
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血清浓度高时会有干扰
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对细胞有毒性
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灵敏度比放射性同位素51Cr低
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操作繁琐，增加误差
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不适合悬浮细胞
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试剂需现配现用
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产品性状
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粉末
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液体
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液体、冻干粉
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MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理：CCK-8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
乳酸脱氢酶(LDH)法检测原理：乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定，检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST®（无色）还原成甲臜产物（橙色），WST®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。
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1960年Nachlas等进行了以乳酸脱氢酶(LDH)的释放为指标的细胞损伤实验后，以检测LDH作为一种确认细胞状态方法的相关文献在全球的数量越来越多（图1）。本次例举4篇近年发表过的文献，均通过检测LDH的释放确定细胞损伤率。
Watanabe等研究水通道蛋白（AQP，膜蛋白质）的机理及与疾病的关联1)。已知AQP与细胞内水的转运有关，近年的研究表明，AQP也会透过甘油、H2O2等小分子，甚至对细胞增殖及迁移产生影响。Watanabe等为证实AQP-9对H2O2转运的影响，通过利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2细胞及H2O2荧光探针(CM-H2DCFDA)进行细胞对外源性H2O2的抑制实验。实验中，利用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®检测LDH的释放并确定由抑制H2O2转运引起的细胞伤率。结果，对照组正常细胞进行H2O2转运并检测到CM-H2DCFDA荧光，同时检测出LDH释放确认细胞受损。实验组细胞敲除AQP-9，细胞内没有检测出H2O2，并通过测定LDH的释放确认没有发生细胞损伤（图2）。
图2 检测AQP-9敲除的细胞内H2O2及LDH的释放
此外，Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮细胞(HEECs)ATP的释放，同时确认有无LDH释放增加3)。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine对原代神经细胞诱导凋亡后，以caspase3、Annexin V及LDH为指标进行测定4)。对于细胞损伤而言，通过检测几种不同原理的指标进行实验结果的相互验证。同仁化学研究所生产并销售各类细胞增殖、毒性、损伤检测试剂盒及细胞染色等试剂，旨在以此帮助实验者阐明细胞内各类机理。
《参考文献》
1) S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.
2) S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.
3) L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.
4) S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.
技术支持：
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